1495-1498 yılları arasında yapılan bu duvar resmi, Milano'daki Santa Maria delle Grazie Manastırı'nın yemekhanesinde bulunur ve İsa'nın on iki havarisiyle son yemeğini, Yuhanna İncili'ndeki ihanet anını konu alır. Leonardo, düzensiz çalışma temposuna uyum sağlamak için fresk yerine tempera, sıva ve reçine karışımı kullanmıştır; bu tercih eserin zamanla bozulmasına yol açmıştır. Mekân kullanımı, perspektif hakimiyeti ve figürlerin duygu ifadeleri, resmi Batı sanatının en tanınan eserlerinden biri yapmıştır. Eser, Leonardo'nun hamisi Milano Dükü Ludovico Sforza'nın kilise ve manastır binalarını yenileme planının bir parçası olarak sipariş edilmiştir.
Leonardo bu duvar resmini yaparken alışılmış fresk tekniğini bir kenara bırakıp kendi karışımını denedi, çünkü sık sık geri dönüp detayları değiştirmek istiyordu. Bu özgür çalışma biçimi ona esneklik kazandırsa da, kullanılan malzemeler nemli manastır duvarında uzun ömürlü olmadı. Resmin merkezinde İsa'nın az önce söylediği bir cümle var: aralarından birinin ona ihanet edeceği haberi. Leonardo, bu haberin havariler arasında yarattığı şaşkınlık ve telaşı, her figürün yüzünde ve el hareketinde ayrı ayrı işlemiş. Sahne, klasik bir grup portresinden çok, an içinde donmuş bir tiyatro sahnesi gibi kurgulanmış. Sforza'nın yenileme projesi kapsamında sipariş edilen eser, manastır yemekhanesinin duvarına adeta bir pencere gibi yerleşmiş. Yüzyıllar boyunca defalarca restore edilen resim, bugün hâlâ orijinal duvarında, ait olduğu mekânda görülebiliyor.